2012年12月13日－12月16日，由国家中医药管理局中药资源普查试点工作专家指导组主办，中国科学院昆明植物研究所、广西中药资源普查试点工作领导小组办公室承办的中药资源分子鉴定技术培训班在广西药用植物园如期举行。培训班日程分为开班仪式、课堂培训、实验操作及总结讨论几部分。国家中医药管理局科技司副司长、中国中医科学院副院长、国家中医药管理局中药资源普查试点工作专家指导组组长黄璐琦，自治区卫生厅副厅长、自治区中医药管理局局长、广西中药资源普查试点工作领导小组办公室主任甘霖，广西科学院副院长、广西药用植物园主任缪剑华，中科院昆明植物所副研究员高连明等领导和专家参加开班仪式。来自北京、内蒙古、甘肃、山西等14个省市的19家单位共54名学员参加了此次培训。现纪要如下。

一、开班仪式。12月14日上午培训班开班仪式由广西科学院副院长、广西药用植物园主任缪剑华主持，首先甘霖代表广西壮族自治区卫生厅、中医药管理局、自治区中药资源普查试点工作领导小组办公室对培训班顺利开班表示热烈的祝贺!对各位领导、各位专家来到广西传经送宝表示热烈的欢迎！表示此次培训班是各省（区、市）中药资源普查工作者一次难得的互相学习和取经的机会，也是对广西中药资源普查试点工作一次很好的促进。肯定了广西药用植物园作为本次培训班的承办单位，对本期培训班做的充分准备和精心安排，同时希望各位学员尤其是参与普查的队员能够珍惜这次学习机会，细心钻研，掌握中药资源分子鉴定的方法和要点，回去后能够独立运用并且指导其他人员开展工作，为保障本次普查结果的科学性、准确性以及成果导向打下基础，达到通过试点工作培养和锻炼人才，建立一支专业化的可长期承担中药资源调查任务及相关工作的技术服务队伍的目的。高连明副研究员代表中科院昆明植物所对培训班的安排情况进行介绍，表示培训的内容非常丰富，理论性、实践性、针对性都比较强；中科院昆明植物所所长李德铢带领的资源及分子生物学实验中心的老师们对培训班进行理论及实验指导。国家中医药管理局科技司副司长、中国中医科学院副院长黄璐琦代表国家中医药管理局中药资源普查试点工作专家指导组首先对第四次全国中药资源普查的背景、指导思想及工作进展进行了介绍。其次就中药资源保护介绍了种源保护、种群保护、种植保护、新药源开发保护和生物技术保护等五种中药资源类型保护研究模式，其中生物技术保护是最有特点的。然后就中药资源生产中的品种鉴定问题、土壤修复问题和有效成分的生产问题进行了讲解。在品种鉴定方面突出分子鉴定在中药材生产中的应用，通过从不同产地、生长年限、品种基原、栽培起源等鉴别到中药材真伪优劣鉴定。生长年限鉴别在中药材鉴别中具有重要性，比如人参其生长年限影响有效物质的积累从而影响药效，这方面上传统鉴别就显示出局限性，可通过分子鉴别方法来解决这个难题，中药所研究的基于端粒长度测定的人参年限鉴别方法也已经申请专利。此外黄璐琦研究员对培训班的学员提出可做为案例的思考题：一、冬虫夏草和虫草菌丝能否用分子鉴定的方法来鉴别。二、通过水提后的冬虫夏草和虫草菌丝还能否进行鉴别以及鉴定的方法。希望培训班的老师和学员能够积极讨论，并可做为一项课题进行研究。其中蕲蛇、乌梢蛇分子标识识别已经收入2010版《中国药典》，这也是分子鉴定技术首次被收入中国药典。有效成分的研究中分子生物技术也占有重要作用，比如合成生物学研究中发现一条新的丹参二萜类有效成分生成的基因调控途径，将关键酶基因导入工程菌中生产有效成分这项成果证实了中药药用活性成分单一化合物异源生产的可行性，并具有重要的科学意义和应用价值。其中重要的药用萜类活性成分及其功能基因的筛选也将作为国家重要课题立项研究。下一步国家中药资源中心即将挂牌成立，这是集科研和管理系统为一体的机构，希望伙计们为伟大的事业努力！奋斗！

二、课堂培训。中科院昆明植物研究所高连明副研究员首先对植物DNA条形码研究进展与应用前景进行了介绍，通过DNA条形码的研究背景与发展前景、国际上植物DNA条形码研究的主要项目、国内DNA条形码发展的背景与主要研究项目、植物DNA条形码筛选的现状与最新进展、植物DNA条形码技术的应用实例、第二代测序技术在DNA条形码中的应用、植物DNA条形码与iFlora计划几个方面的详细介绍，强调DNA条形码对物种的有效、快速鉴定、发现隐存物种，促进生物多样性的发现等意义不仅是传统物种鉴定的强有力补充，更由于它采用数字化形式，使样本鉴定过程能够实现自动化、标准化和全球化，突破了对经验的过渡依赖，并可进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。最大优点在于可利用生物残迹（血渍、羽毛痕迹、组织碎片等）来鉴定形态学无法鉴定的已知或未知物种，因此，在生物物种鉴定、国家卫生检疫、国家重要生物战略资源鉴定、新物种资源的发现等方面具有广泛的应用前景。最后提出几点预期目标：一、获取DNA条形码的批量标准数据，构建植物物种DNA条形码的标准数据库，实现中国重要和常见维管植物属级水平的分子鉴定。二、通过集成和创新，建设基于云服务技术的信息共享和应用平台，为国家相关产业部门和公众便捷、准确了解与获取植物多样性和遗传信息提供全新认知手段和平台。三、iFlora理念的提出和实施，将培育和拓展我国物种识别圈(taxasphere)和生物文化圈 (bioliterate world)，可能成为引领国际植物科学发展新的生长点。 

中国中医科学院中药研究所袁庆军副研究员介绍中药分子鉴定方法和原则。主要介绍中药鉴定的发展、物种进化机制及分子鉴定的本质、中药分子鉴定的特点及存在的问题和中药分子鉴定的方法和原则四个方面。中药鉴定经历了感官鉴别、显微鉴别、理化鉴别、分子鉴别四个时期。物种通过谱系分选过程得到多系群、并系群、单系群，当植物中存在杂交和多倍化时，此时植物比动物难以实现分子鉴别。此外中药分子鉴定要求准确性强，特点是复杂性高，因其种质混杂使其鉴别难度大。目前中药分子鉴定存在两个局限，一是来自技术本身的，二是来自研究对象的，DNA条形码存在不完全的种内变异和不完全的种间分化，中药DNA条形码则存在取样的不完全性，难以客观反映种间遗传间断，从而影响中药分子鉴定的可靠性和准确性。根据鉴定对象亲缘关系的远近将中药鉴定分为四类:真伪品鉴定、正品与替代品鉴定、多基源鉴定和产地鉴定。

中国科学院昆明植物研究所张挺助理研究员讲解植物标本的采集规范与图片的质量要求。标本采集规范要求有五点：标本采集完整；每号采集三份并提交一份，对于个体较小的特种标本需要采集多个个体；野外采集记录详实；标本准确鉴定，鉴定后数据电子化；标本制作完整需要附有采集信标签和鉴定信息标签。图像的采集需要对生境，植物全株，局部特写如花、果及其它记录鉴定特征的图像，一般照片3－5张为宜，图像大小不低于2048×1536。建议文件夹编号与采集编号一致，采集号用字母和数据组合，图片要求必须命名（大生境、小生境、植株、花、果实…）。标本压制过程中可使用硫酸纸，这种纸具有防潮、不粘黏的特点。使用硫酸纸干燥后的标本颜色不易改变，不会粘黏在纸上，方便上台纸等特点，另外精细结构花解剖后分开干燥，含水量高的根、茎剖开后更易干燥，标本野外现采现压，及时记录数据。对烘箱烘干法、草纸压干法、报纸烘干法三种干燥标本方法的优、缺点进行了说明。在下午植物DNA材料采集实践中张挺带领学员在广西药用植物园实地演练植物标本和分子材料的采集规范，并对标本的压制、记录等内容进行了详细的讲解。

中科院昆明植物研究所高连明副研究员介绍植物DNA条形码的采集策略、DNA材料采集的技术规范和要求。样品采集策略的制定需要根据研究目标来确定,通常不同的研究目标,样品的采集策略也不尽相同，有的基于特定科、属的采集，有的基于特定样方(plot)和区域研究的采集。物种的分布范围越广,则需要采集的样品数量越多,这样才能最大限度地代表物种的遗传变异范围。对于植物DNA条形码研究, 每个物种需要的样品数为8－10 个个体, 且至少来自5 个不同的地域或居群。研究材料为野生植物，尽量不使用栽培的材料。针对普通植物、叶片易失水的植物、多浆或肉质植物、微小植物、叶片较大的植物遗传物质的采集规范不尽相同。干燥植物分子材料最好选用透气性好的纸袋并注意材料要与硅胶分离，纸袋上包括种名、采集号、采集日期和采集地信息等。最后介绍了植物分子材料的保存规范及DNA提取的质量标准。

中国中医科学院中药研究所袁媛副研究员介绍中药材分子鉴别现场运用探讨。主要从分子鉴别现场运用的意义、策略和实践三个方面进行讲解。首先了解药材鉴别包括基源植物、药材、复方药、中成药等，面对这些药材鉴别问题，分子鉴别方法得到发展并遇到挑战，这其中有三个方面的原因：一、DNA条形码技术的快速发展，这是数据的准备；二、中药资源普查的全面启动，这是样品的准备；三、药材分子鉴别技术的发展，这是技术的准备。分子标记技术一步步从传统分子标记技术到基于通用片段再发展到功能基因。随着DNA快速提取技术的发展，使中药材分子现场鉴定成为可能，现在DNA快速提取技术已经发展到5－10 min就可完成,然后通过扩增反应，检测和真伪判定就可得到结果。

中科院昆明植物研究所高连明副研究员就标准基因的选择与序列标准进行介绍。从获得的atpF-H、rpoB、rpoC1、psbK-I、matK等植物片段筛选得到rbcl、matK、trnH-psbA、ITS四个DNA候选条形码片段，中国植物条形码研究团队（ China Plant BOL Group，19单位 62人）对种子植物75科141属1757种的这四个DNA候选条形码片段的引物通用性、序列质量和物种分辨率分析后建议将ITS(ITS2)作为种子植物的核心DNA条形码（matK+ITS)。条形码研究包括使用引物、PCR成功率、测序成功率、物种鉴别效率等几个重要指标。PCR产物的扩增及纯化根据扩增效率及功能性也有不同的选择方法，对获得的序列必须要进行检查，排除假基因及可能污染的序列。进行DNA条形码数据提交时要注意序列的命名原则、序列方向、序列长度等要求，每个条形码必须使用正向、反身两个引物进行测序，以尽可能多的保留位点信息。

三、实验操作。12月15日，学员在中科院昆明植物所杨静、王磊和张志荣的指导下进行了植物总DNA提取技术实践、PCR反应操作实践。首先杨静对DNA提取的原理，方法和质量要求及检测方法进行简要介绍，并指出目前不同提取方法的优缺点，推荐此次培训班使用的天根新型植物基因组DNA提取试剂盒（型号:DP320），相比其它方法具有方便、快捷，成本较低等优点。张志荣在简单讲解了PCR反应的原理、反应体系、反应条件后突出PCR反应的常见问题包括无扩增产物、非特异性产物和拖尾等情况，告知学员出现这些问题产生的原因，以避免学员在实际操作出现此类问题。12月16日上午，针对PCR产物进行检测实践对产物纯化、测序反应进行介绍。

四、总结讨论。12月16日下午，中科院昆明植物所曾春霞工程师讲解条形码数据分析与上传并通过相关软件进行现场演示。获得测序结果通过名称标准化、序列标准化、序列拼接、格式转换后进行序列比对和分析。常用的序列拼接软件有Sequencher、DNASTAR等软件，常序列比对和分析软件有MEGA、Clustal X、Bioedit，其中MEGA较为常用。特别说明了比对时的序列名称标准。

培训期间学员针对培训内容提出以下几个问题：一、如何确定所测序列是植物序列而非真菌污染。二、根据系统发育树结果是否可以直接界定不同种或新种。三、本次实验中扩增产物出现非特异性扩增的原因以及如何解决。四、PCR结果检测因EB的致癌性可否用其取代品等问题。

本次培训共邀请了3家单位的10名老师进行授课，授课内容涵盖了中药资源分子鉴定技术方面的研究进展、技术规范与标准以及实验技术操作培训几大项内容。通过分子鉴定技术解决中药资源鉴定中经典分类的方法遇到的资源种类繁多，来源复杂，品种混淆厉害等问题，解决普查内业整理过程中标本鉴定方面碰到的一些困难，是本次培训班的目的所在。在贯彻试点工作“创新思路、探索机制、提供示范”的原则上，进一步增加本次普查的技术含量，促进普查试点工作成果的形成，为普查工作提供了很好的理论和技术指导。